Лазерный анализатор агрегации биофармпрепаратов «Aggregates Sizer» — это лазерный анализатор размеров частиц SALD-7500nano с опционным программным обеспечением WingSALD bio с помощью которого можно определять концентрацию (в мг/мл) агрегаций в исследуемых образцах.

Агрегаты в биофармацевтических препаратах можно разделить на 3 категории исходя из их размеров: IVP (In-visibleParticle – Невидимые глазом частицы), SVP (Sub-visible Particle – Субвидимые частицы) и VP (Visible Particle – Видимые глазом частицы).

До настоящего момента ни один прибор не мог перекрыть весь диапазон SVP (Субвидимых частиц) в рамках выполнения всего одного измерения. Поэтому приходилось использовать сразу несколько методов. Aggregates Sizer полностью перекрывает SVP диапазон.

* В основе прибора Aggregates Sizer лежит метод лазерной дифракции. Калибровку по концентрации (единицы измерения мкг/мл) проводят при помощи калибровочного образца, содержащего частицы полистирольного латекса.

1 Количественная оценка концентрации агрегаций биофармацевтических препаратов в SVP диапазоне
Aggregates Sizer измеряет распределение размеров агрегаций биофармацевтических препаратов в широком диапазоне: от 7 нм до 800 мкм. При этом отображается процентное содержание частиц того или иного размера нормированное на 100 %. Прибор способен также проводить количественную оценку концентрации агрегаций (в мкг/мл) в диапазоне от 100 нм до 10 мкм.

Диапазон измерения распределения размеров частиц: от 7 нм до 800 мкм
Диапазон количественной оценки концентрации частиц: от 40 нм до 20 мкм

2 Чувствительность измерений
Чувствительность Aggregates Sizer более чем в 10 раз превышает чувствительность приборов SALD для оценки распределения размеров частиц предыдущей серии (SALD-7100). Это означает, что даже при очень малых размерах пробы можно рассчитывать на высокоточный результат при использовании одноразовых микрокювет объемом 0,4 мл.

3 Количественная оценка процессов агрегации с интервалом в одну секунду
Изменения (размеров и количества) в агрегациях могут быть подтверждены количественно при помощи оценки концентрации (в мкг/мл) с интервалом измерения в одну секунду. Это позволяет наблюдать различные промежуточные стадии формирования агрегаций, а не давать оценку строго «до» и «после» каких-либо изменений. Благодаря этому можно оценить скорость протекания тех или иных процессов. При использования емкостной ячейки объемом 5 мл можно наблюдать процессы агрегации во время перемешивания образца механическим путем.

Основы метода лазерной дифракции

Между диаметром частицы и дифракционной картиной рассеянного излучения имеется однозначная взаимосвязь

При взаимодействии частицы с лазерным лучом происходит рассеяние излучения в разных направлениях. Это излучение называется «рассеянным». Пространственное распределение интенсивности, в зависимости от угла рассеяния, называется «дифракционной картиной» или «картиной распределения интенсивности рассеянного излучения». Если частица имеет большие геометрические размеры, рассеиваемое ею излучение будет направлено вперед (то есть в направлении лазерного пучка) и колебания интенсивности в зависимости от угла рассеяния будут слишком малы, чтобы их можно было представить в виде графика. Интенсивность излучения, распространяемого такой частицей в обратном и боковом направлениях, будет пренебрежимо мала по сравнению с интенсивностью излучения в прямом направлении.

По мере уменьшения размера частицы, расширяется дифракционная картина. И если размер частицы становится еще меньше, начинает возрастать доля излучения рассеянного в боковом и обратно направлениях. Картина распределения излучения таких частиц становится похожа на цилиндр с уширением на краях и демонстрирует, что излучение распространяется во всех направлениях. Именно на этом базируется однозначная взаимосвязь между диаметром частицы и дифракционной картиной и размер частицы может быть рассчитан исходя из картины распределения интенсивности рассеянного света.

Использование фиолетового лазера позволяет осуществлять точные измерения частиц ультрамалого размера
Дифракционные картины, получаемые от частиц размером порядка нескольких десятков нанометров очень близки друг к другу. Это явление, вызванное пределом обнаружения метода лазерной дифракции, в значительной степени затрудняет получение правильного распределения размеров частиц. Фиолетовый лазер создает более четкую дифракционную картину по сравнению с красным лазером, поэтому он используется для получения более качественных результатов распределения размеров частиц порядка десятков нанометров.

Измерение проб
Измерение распределения размеров частиц осуществляется не на основе измерения одной единственной частицы. Оно осуществляется на пробах, состоящих из большого числа частиц. Пробы состоят из частиц различного размера, и дифракционная картина всей пробы является суперпозицией дифракционных картин каждой отдельно взятой частицы. Распределение размеров частиц, иными словами, пропорциональное соотношение частиц различного размера, рассчитывается из регистрируемой дифракционной картины всей пробы. Это и есть основной принцип метода лазерной дифракции.

Оптическая схема Aggregates Sizer
Направленный пучок лазерного излучения (источник: полупроводниковый фиолетовый лазер) проходит через коллиматор и взаимодействует с пробой, представляющей собой группу частиц различного размера. Излучение, рассеянное пробой в прямом направлении с углом рассеяния до 60°, улавливается фокусирующей линзой. Детектор в форме «крыла», состоящий из концентрически-расположенных сенсорных элементов, располагается строго на фокусном расстоянии линзы. Боковое и обратное излучение регистрируется специальными датчиками, расположенными сбоку и сзади. Таким образом, при помощи перечисленных детекторов регистрируется полная картина рассеянного излучения.

Регистрация и обработка данных об интенсивности рассеянного излучения
В лазерном анализаторе Aggregates Sizer распределение частиц по размерам рассчитывается исходя из данных распределения интенсивности рассеянного излучения. Суммарное распределение потока излучения и схема обработки данных показаны на рисунке слева. Весь процесс, начиная с операции детектирования излучения и заканчивая выводом результатов расчёта распределения размеров частиц, выполняется автоматически в рамках единого алгоритма. До настоящего момента метод лазерной дифракции позволял получать данные о нормированном на 100 % распределении размеров частиц. Анализ размеров частиц при помощи Aggregates Sizer позволяет получить данные о концентрации (единицы: мкг/мл) при помощи оценки интенсивности рассеянного излучения после калибровки стандартным образцом полистирольного латекса.

Анализ агрегаций в субвидимом диапазоне при помощи одной прибора
При использовании программного обеспечения «WingSALD bio» вертикальную ось графиков можно вывести как «концентрацию» (единицы: мкг/мл) и содержание частиц можно оценить количественно.

Высокая повторяемость
Стабильная оптическая система Aggregates Sizer и метод лазерной дифракции позволяют регистрировать рассеянное излучение с высокой точностью.

В таблице ниже показаны результаты измерения стандартного образца полистирольного латекса с размером частиц 1 мкм. Воспроизводимость оценивалась при концентрациях 0,5 ppm; 1 ppm; 2,5 ppm и 5 ppm. Коэффициенты вариации (КВ) измерений не превышают 3%.

Высокое разрешение — точное разделение пиков полифракционных образцов
Интенсивность излучения, рассеянного частицами большого размера, высока и сильно меняется даже при небольшом изменении угла (значения угла рассеяния для частиц большого размера также невысоки). В то же время интенсивность излучения, рассеянного частицами малого размера изменяется очень слабо в зависимости от угла. При этом значения угла рассеяния для частиц малого размера выше, чем для больших частиц.

В Aggregates Sizer используется детектор в виде «крыла» (Wing sensor II), который состоит из 78 концентрически-расположенных светочувствительных элементов. Площадь чувствительных элементов логарифмически увеличивается от центра к краям. Благодаря такому строению детектора прибор сохраняет высокую точность измерения интенсивности рассеянного излучения широкого диапазона размеров частиц.

Количественная оценка изменения агрегаций в течение времени
Непрерывные измерения до 15 часов подряд
Минимальный интервал отслеживания изменения размеров и концентрации агрегаций в субвидимом диапазоне составляет 1 секунду, что даёт возможность оценки состояния агрегаций в течение времени и используется для оценки стабильности образца.

ЗАМЕЧАНИЕ

Быстрые измерения с минимальным интервалом в одну секунду становятся возможны благодаря применению оптической системы с одним источником излучения. Это позволяет проводить непрерывную оценку изменения состояния агрегации протеинов, входящих в состав биофармацевтических препаратов.

В соответствии с ГОСТ Р 59545-2021 «Нанотехнологии. Наносуспензии для методов in vitro. Основные характеристики и методы измерений», который вступит в силу 01.03.2022 года, метод, основанный на дифракции лазерного излучения (ДЛИ) является рекомендуемым (пока не установленным) для определения стабильности наносуспензий. Стабильность наносуспензии является её ключевой характеристикой. Агрегация/агломерация и осаждение нанообъектов под действием гравитационных сил являются основными факторами, влияющими на стабильность наносуспензии.

Измерение агрегации с применением механического перемешивания
Значительное сокращение многодневного анализа агрегаций
Можно проводить анализ образцов с использование функции механического перемешивания емкостной ячейки. Это ускоряет исследование процессов агрегации протеинов без использования какого-либо дополнительного оборудования и программного обеспечения.

Конфигурация прибора

Конфигурацию прибора подбирают для решения конкретной задачи, объекта измерения, условий и режима работы

Измерение образцов с концентрацией 0,1 ppm
SALD-7500nano

• Полупроводниковый УФ лазер (405 нм), не требует технического обслуживания, например замены газа.
• Детектор имеет 78 светочувствительных элементов спереди, один элемент сбоку и 5 элементов сзади, всего 84 элемента.
• Все элементы сконструированы на основе высокочувствительных сенсоров, настроенных на фиксацию импульсов фиолетового полупроводникового лазера.
• Измерительные ячейки жестко фиксируются на специальной выдвижной платформе. Благодаря ей замена измерительных ячеек осуществляется быстро и просто.
• Прибор комплектуется стандартным программным обеспечением WingSALD bio. Это программное обеспечение позволяет проводить как сложную многоступенчатую обработку данных, так и экспресс-анализы, что обеспечивает выполнение широкого спектра задач.

Измерение образцов объемом 0,4 мкл
Одноразовые ячейки

• При помощи метода лазерной дифракции теперь можно измерять и высококонцентрированные образцы.
• Высококонцентрированный образец помещают между двумя предметными стеклами.
• Образцы, склонные к диспергированию или агломерации в процессе растворения, измеряются в их исходном состоянии, либо с минимальным присутствием дисперсионной среды. В результате этого вы получаете истинные данные пробы.
• Кремы для рук, маски для лица, растворы для линз и прочие доступные в открытой продаже суспензии больше не требуют сложной пробоподготовки.

Принцип измерения высококонцентрированных образцов
При измерении образцов с высокой концентрацией в проточной или емкостной ячейках большая оптическая длина пути приводит к многократному светорассеянию. Благодаря расположению образца между двумя предметными стеклами оптическая длина пути уменьшается, что позволяет избежать эффекта многократного светорассеяния и осуществить точное измерение.

Кроме того, расположение предметных стекол под углом к оптическим осям делает возможным детектирование бокового излучения. Анализ сигнала, зафиксированного фронтальными и боковыми светочувствительными элементами, позволяет измерять высококонцентрированные образцы с малым размером частиц.

Изучение агрегаций в процессе механического перемешивания
Емкостная ячейка [SALD-BC75]

• Измерение малого количества пробы в небольшом количестве дисперсионной среды.
• Объем емкостной ячейки составляет всего 5 см3, что позволяет снизить стоимость анализа за счет сокращения объема пробы и дисперсионной среды.
• Вертикальное перемешивание предотвращает оседание частиц пробы.
• Тетрафторэтиленовая воронка уменьшает вероятность разлива образца при перемешивании и предотвращает попадание пробы на руки пользователя и на поверхность ячейки. Поверхность ячейки остается чистой.

Технические характеристики

Функция Помощника помогает создать стандартные операционные процедуры (СОП) для обеспечения максимальной повторяемости условий испытания и результатов измерений
Возможность создания, сохранения и передачи информации об условиях испытания и методах предварительной подготовки образцов обеспечивает повторяемость результатов и позволяет проводить корректное сравнение результатов, даже если измерения выполняют разные операторы на разных машинах, расположенных на разных предприятиях. При использовании функции Помощника вся последовательность действий отображается на экране, что упрощает использование прибора операторами, не имеющими большого опыта работы.

Программное обеспечение имеет возможность разграничения уровня доступа для контроля безопасности процессов измерения.

Отслеживание состояния образца во времени
Интенсивность рассеянного излучения является основой для проведения расчетов и вычисления распределения частиц по размерам. Обе эти характеристики могут отображаться в режиме реального времени. Это означает, что диспергирование или агломерация частиц образца, будут видны на экране.

Использование единого принципа измерения, одной оптической системы и одного источника света позволяет получать результаты во всем заявленном диапазоне размеров частиц без «склейки» данных. Оптическая система непрерывно улавливает рассеянное в прямом направлении излучения в диапазоне до 60° при помощи единого плоского детектора

Измерение размеров частиц во всем заявленном диапазоне осуществляется при помощи единого принципа измерения, одной оптической системы и одного источника излучения. Это позволяет избежать «склейки» данных как в случае использования, например, нескольких источников света.

В основу оптической системы детектирования рассеянного излучения входит сложная современная технология регистрации его интенсивности. Фиксация прямого рассеянного излучения в диапазоне до 60° становится возможной на поверхности одного-единственного детектора. Это повышает разрешение в области частиц с малым диаметром.

Стабильная оптическая система
Надёжная амортизирующая конструкция полностью изолирует все элементы оптической системы от ударов и вибраций. Это исключает проблемы, связанные с регулировкой оптической оси.

WingSensor II — детектор с высокой чувствительностью
Рассеянное излучение в прямом направлении регистрирует детектор “Wing sensor II”, который состоит из 78 чувствительных элементов на основе современных полупроводниковых материалов. Этот детектор прекрасно справляется с задачей регистрации малоуглового рассеянного излучения благодаря высокому разрешению чувствительных элементов. Также он способен регистрировать даже относительно слабое рассеянное излучение на больших углах из-за высокой чувствительности элементов на периферии. Кроме того, боковое излучение фиксируется отдельным чувствительным элементом, а обратное рассеянное излучение еще пятью датчиками обратного светорассеяния. Таким образом при помощи 84 чувствительных элементов вы сможете провести высокоточные измерения распределения размеров частиц с высоким разрешением во всем диапазоне диаметров.

Простое и понятное управление благодаря функции самодиагностики
В анализаторе Aggregates Sizer предусмотрена эффективная функция самодиагностики. В ходе работы осуществляется контроль сигнала светочувствительных элементов и статуса прибора, что значительно упрощает процесс измерения. Благодаря наличию журнала регистрации операций, в котором содержится полная информация о результатах измерений, состоянии прибора и степени загрязнения измерительной ячейки, вы всегда можете быть уверены в достоверности полученных данных.

Технические характеристики

Общая спецификация

Примечание 1: Диапазон измерения зависит от формы частиц и прочих параметров.

Примечание 2: Данные о точности основаны на результатах измерения эталонного образца, поставляемого с прибором, согласно стандартной процедуре.

Примечание 3: Диапазон измеряемых концентраций зависит от формы частиц и прочих параметров.

Основной блок: SALD-7500nano

Примечание 4: В комплект поставки входят эталонный образец и USB-кабель длиной 2 метра для подключения к ПК.

Емкостная ячейка: SALD-BC75

Одноразовая ячейка